Centre National de Référence des Leishmania

Identification des Leishmania

- Identification isoenzymatique Toutes les souches ont été identifiées par électrophorèse des isoenzymes. Cette technique, utilisée depuis 1981, est réalisée par électrophorèse en gel épais d’amidon avec quinze systèmes enzymatiques (Rioux, J.A., Lanotte, G., Serres, E., Pratlong, F., Bastien, P., & Périères, J. Taxonomy of Leishmania, use of isoenzymes. Suggestions for a new classification. Annls Parasitol hum comp., 1990, 65, 111-125). Les enzymes utilisés sont les suivants : malate déshydrogénase, MDH, EC 1.1.1.37 ; enzyme malique, ME, EC 1.1.1.40 ; isocitrate déshydrogénase, ICD, EC 1.1.1.42 ; 6-phosphogluconate déshydrogénase, PGD, EC 1.1.1.44 ; glucose-6-phosphate déshydrogénase, G6PD, EC 1.1.1.49 ; glutamate déshydrogénase, GLUD, EC 1.4.1.3 ; NADH diaphorase, DIA, EC 1.6.2.2 ; purine nucléoside phosphorylase, NP 1, EC 2.4.2.1 ; purine nucléoside phosphorylase, NP 2, EC 2.4.2.* ; glutamate-oxaloacétate transaminase, GOT 1, EC 2.6.1.1 ; glutamate-oxaloacétate transaminase, GOT 2, EC 2.6.1.1 ; phosphoglucomutase, PGM, EC 5.4.2.2 ; fumarate hydratase, FH, EC 4.2.1.2 ; mannose phosphate isomérase, MPI, EC 5.3.1.8 ; glucose phosphate isomérase, GPI, EC 5.3.1.9.

Depuis 1989, la technique d’isoélectrofocalisation, plus résolutive, est utilisée en complément (Piarroux, R., Trouvé, V., Pratlong, F., Martini, A., Lambert, M. & Rioux, J.A.. The use of isoelectric focusing on polyacrylamide gel for the enzymatic analysis of Old World Leishmania species. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1994, 88, 475-478).

Pour la préparation des extraits protéiniques en vue d’une identification enzymatique, des cultures de masse sont réalisées à partir de milieu cœur-cerveau-sang.

L’électrophorèse des isoenzymes, le principe et les méthodes de révélation sont indiqués dans le livre de N. Pasteur (Pasteur N., Pasteur G., Bonhomme F., Catalan J., Britton-Davidian J.- Manuel technique de génétique par électrophorèse des protéines. Lavoisier, 1987 : 217 p.).

Après électrophorèse, les enzymes contenues dans les extraits protéiniques sont révélées par une « tache colorée » appelée électromorphe. Celui-ci correspond à la distance parcourue par l’enzyme dans un gel d’amidon à un pH déterminé. Dans le cas des déshydrogénases, le produit de la réaction colorée est un précipité bleu de formazan. Le zymodème est établi après obtention de 15 électromorphes correspondant aux 15 isoenzymes utilisés. On définit par "zymodème" l’ensemble des souches présentant le même profil enzymatique.

Les Leishmania se caractérisent par un grand polymorphisme. Plus de deux cents zymodèmes sont à ce jour individualisés. A chaque zymodème est affectée une souche marqueur dont l’une : MHOM/FR/78/LEM 75, L. infantum MON-1, est la souche étalon qui sert de référence pour identifier chaque électromorphe.

- Identification moléculaire des Leishmania

L’identification moléculaire est réalisée depuis fin 1998. L’identification est basée sur l'analyse du polymorphisme nucléotidique d'une région de 1265 pb du gène de la RNA polymérase II, à partir d'un travail original de Croan et coll. (Biochem. Parasitol. 1997, 89, 149-159). L'intérêt de cette approche, qui fait appel aux techniques d'amplification génétique et de séquençage, est d'utiliser des amorces « universelles », valables pour toutes les espèces du genre Leishmania. Cette méthode a nécessité préalablement le séquençage de cette région pour toutes les espèces de Leishmania connues. La banque du CNRL contient 31 espèces différentes de Trypanosomatidés, parmi lesquelles 26 appartiennent au genre Leishmania. Ce travail a montré qu'il existe un polymorphisme nucléotidique de la région étudiée, permettant de distinguer spécifiquement chacune de ces espèces entre elles. Cette technique est actuellement utilisée systématiquement en parallèle avec l’identification isoenzymatique. Cette approche moléculaire présente deux avantages principaux : elles est pratiquée directement sur les prélèvements biologiques (biopsies cutanées, moelle osseuse, sang) avec une meilleure sensibilité que la culture et son délai de réponse est rapide (moins de 10 jours).